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Prof. Henry "Indiana" Jones Jr. (H. Ford) und sein Kollege Mac werden von russischen Agenten entführt und sollen diesen helfen eine Kiste mit den Überresten eines unbekannten Wesens zu finden. Indy gelingt zwar die Flucht, aber kaum ist er zu Hause angekommen entzieht man ihm seinen Professoren-Job, da die US-Regierung vermutet, dass Indy ein Doppelagent sei. Als es jedoch fast schon nicht mehr schlimmer kommen konnte taucht plötzlich auch noch ein Junge namens Mutt Williams (S. LaBeouf) auf, der Indy einen Brief von dessen altem Freund, Professor Oxley, überreicht, den dieser kurz vor seinem Verschwinden Mutts Mutter zugeschickt hat. Kurz darauf verschwand jedoch auch sie spurlos. Indy und Mutt machen sich sofort auf den Weg nach Nazca (Peru) um den Spuren des Briefes nachzugehen...